當前位置：首頁 > 新聞中心 > 技術(shù)支持 > 色譜儀的原理(lǐ)及分(fēn)析方法
色譜儀的原理(lǐ)及分(fēn)析方法
作(zuò)者：dl-admin2010-05-12 00:00
點贊
收藏
熱(rè)度：577
特點
1．高壓：液相(xiàng)色譜法以液體(tǐ)爲流動相(xiàng)（稱爲載液），液體(tǐ)流經色譜柱，受到阻力較大(dà)，爲了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可(kě)達150～350×105Pa。
2.高速：流動相(xiàng)在柱内的流速較經典色譜快(kuài)得(de)多，一般可(kě)達1～10ml/min。高效液相(xiàng)色譜法所需的分(fēn)析時間較之經典液相(xiàng)色譜法少得(de)多，一般少于1h。
3.高效：近來(lái)研究出許多新型固定相(xiàng)，使分(fēn)離(lí)效率大(dà)大(dà)提高。
4.高靈敏度：高效液相(xiàng)色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分(fēn)析的靈敏度。如(rú)熒光(guāng)檢測器靈敏度可(kě)達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。
5.适應範圍寬：氣相(xiàng)色譜法與高效液相(xiàng)色譜法的比較：氣相(xiàng)色譜法雖具有分(fēn)離(lí)能力好，靈敏度高，分(fēn)析速度快(kuài)，操作(zuò)方便等優點，但(dàn)是受技術(shù)條件(jiàn)的限制，沸點太高的物質或熱(rè)穩定性差的物質都(dōu)難于應用氣相(xiàng)色譜法進行分(fēn)析。而高效液相(xiàng)色譜法，隻要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對于高沸點、熱(rè)穩定性差、相(xiàng)對分(fēn)子量大(dà)（大(dà)于400以上）的有機(jī)物（這些物質幾乎占有機(jī)物總數的75%～80%）原則上都(dōu)可(kě)應用高效液相(xiàng)色譜法來(lái)進行分(fēn)離(lí)、分(fēn)析。據統計(jì)，在已知化合物中，能用氣相(xiàng)色譜分(fēn)析的約占20%，而能用液相(xiàng)色譜分(fēn)析的約占70～80%。
高效液相(xiàng)色譜按其固定相(xiàng)的性質可(kě)分(fēn)爲高效凝膠色譜、疏水性高效液相(xiàng)色譜、反相(xiàng)高效液相(xiàng)色譜、高效離(lí)子交換液相(xiàng)色譜、高效親和液相(xiàng)色譜以及高效聚焦液相(xiàng)色譜等類型。用不同類型的高效液相(xiàng)色譜分(fēn)離(lí)或分(fēn)析各種化合物的原理(lǐ)基本上與相(xiàng)對應的普通液相(xiàng)層析的原理(lǐ)相(xiàng)似。其不同之處是高效液相(xiàng)色譜靈敏、快(kuài)速、分(fēn)辨率高、重複性好，且須在色譜儀中進行。
高效液相(xiàng)色譜法的主要類型及其分(fēn)離(lí)原理(lǐ)
根據分(fēn)離(lí)機(jī)制的不同，高效液相(xiàng)色譜法可(kě)分(fēn)爲下述幾種主要類型：
1．液—液分(fēn)配色譜法Liquid-liquidPartitionChromatography及化學鍵合相(xiàng)色譜ChemicallyBondedPhaseChromatography
流動相(xiàng)和固定相(xiàng)都(dōu)是液體(tǐ)。流動相(xiàng)與固定相(xiàng)之間應互不相(xiàng)溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分(fēn)界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相(xiàng)間進行分(fēn)配。達到平衡時，服從(cóng)于下式：
式中，cs—溶質在固定相(xiàng)中濃度；cm－－溶質在流動相(xiàng)中的濃度；Vs—固定相(xiàng)的體(tǐ)積；Vm—流動相(xiàng)的體(tǐ)積。LLPC與GPC有相(xiàng)似之處，即分(fēn)離(lí)的順序取決于K，K大(dà)的組分(fēn)保留值大(dà)；但(dàn)也有不同之處，GPC中，流動相(xiàng)對K影(yǐng)響不大(dà)，LLPC流動相(xiàng)對K影(yǐng)響較大(dà)。
a.正相(xiàng)液—液分(fēn)配色譜法NormalPhaseliquidChromatography:流動相(xiàng)的極性小于固定液的極性。
b.反相(xiàng)液—液分(fēn)配色譜法ReversePhaseliquidChromatography:流動相(xiàng)的極性大(dà)于固定液的極性。
c.液—液分(fēn)配色譜法的缺點：盡管流動相(xiàng)與固定相(xiàng)的極性要求完全不同，但(dàn)固定液在流動相(xiàng)中仍有微量溶解；流動相(xiàng)通過色譜柱時的機(jī)械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年(nián)代末發展的化學鍵合固定相(xiàng)（見(jiàn)後），可(kě)克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
2．液—固色譜法
流動相(xiàng)爲液體(tǐ)，固定相(xiàng)爲吸附劑（如(rú)矽膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作(zuò)用的不同來(lái)進行分(fēn)離(lí)的。其作(zuò)用機(jī)制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分(fēn)子X和溶劑分(fēn)子S對吸附劑表面活性中心發生(shēng)競争吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可(kě)表示如(rú)下：
Xm+nSa======Xa+nSm
式中：Xm－－流動相(xiàng)中的溶質分(fēn)子；Sa－－固定相(xiàng)中的溶劑分(fēn)子；Xa－－固定相(xiàng)中的溶質分(fēn)子；Sm－－流動相(xiàng)中的溶劑分(fēn)子。
當吸附競争反應達平衡時：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中：K爲吸附平衡常數。[討(tǎo)論：K越大(dà)，保留值越大(dà)。]
3．離(lí)子交換色譜法Ion-exchangeChromatography
IEC是以離(lí)子交換劑作(zuò)爲固定相(xiàng)。IEC是基于離(lí)子交換樹(shù)脂上可(kě)電離(lí)的離(lí)子與流動相(xiàng)中具有相(xiàng)同電荷的溶質離(lí)子進行可(kě)逆交換，依據這些離(lí)子以交換劑具有不同的親和力而将它們分(fēn)離(lí)。
以陰離(lí)子交換劑爲例，其交換過程可(kě)表示如(rú)下：
X-溶劑中+樹(shù)脂-R4N+Cl-===樹(shù)脂-R4N+X-+Cl-溶劑中
當交換達平衡時：
KX=[-R4N+X-][Cl-]/[-R4N+Cl-][X-]
分(fēn)配系數爲：
DX=[-R4N+X-]/[X-]=KX[-R4N+Cl-]/[Cl-]
[討(tǎo)論：DX與保留值的關系]
凡是在溶劑中能夠電離(lí)的物質通常都(dōu)可(kě)以用離(lí)子交換色譜法來(lái)進行分(fēn)離(lí)。
4．離(lí)子對色譜法IonPairChromatography
離(lí)子對色譜法是将一種或多種與溶質分(fēn)子電荷相(xiàng)反的離(lí)子稱爲對離(lí)子或反離(lí)子加到流動相(xiàng)或固定相(xiàng)中，使其與溶質離(lí)子結合形成疏水型離(lí)子對化合物，從(cóng)而控制溶質離(lí)子的保留行爲。其原理(lǐ)可(kě)用下式表示：
X+水相(xiàng)+Y-水相(xiàng)===X+Y-有機(jī)相(xiàng)
式中：X+水相(xiàng)－－流動相(xiàng)中待分(fēn)離(lí)的有機(jī)離(lí)子（也可(kě)是陽離(lí)子）；Y-水相(xiàng)－－流動相(xiàng)中帶相(xiàng)反電荷的離(lí)子對（如(rú)氫氧化四丁基铵、氫氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y－－-形成的離(lí)子對化合物。
當達平衡時：
KXY=[X+Y-]有機(jī)相(xiàng)/[X+]水相(xiàng)[Y-]水相(xiàng)
根據定義，分(fēn)配系數爲：
DX=[X+Y-]有機(jī)相(xiàng)/[X+]水相(xiàng)=KXY[Y-]水相(xiàng)
[討(tǎo)論：DX與保留值的關系]
離(lí)子對色譜法特别是反相(xiàng)發解決了以往難以分(fēn)離(lí)的混合物的分(fēn)離(lí)問(wèn)題，諸如(rú)酸、堿和離(lí)子、非離(lí)子混合物，特别是一些生(shēng)化試樣如(rú)核酸、核苷、生(shēng)物堿以及藥物等分(fēn)離(lí)。
5．離(lí)子色譜法IonChromatography
用離(lí)子交換樹(shù)脂爲固定相(xiàng)，電解質溶液爲流動相(xiàng)。以電導檢測器爲通用檢測器，爲消除流動相(xiàng)中強電解質背景離(lí)子對電導檢測器的幹擾，設置了抑制柱。試樣組分(fēn)在分(fēn)離(lí)柱和抑制柱上的反應原理(lǐ)與離(lí)子交換色譜法相(xiàng)同。
以陰離(lí)子交換樹(shù)脂（R-OH）作(zuò)固定相(xiàng)，分(fēn)離(lí)陰離(lí)子（如(rú)Br-）爲例。當待測陰離(lí)子Br-随流動相(xiàng)（NaOH）進入色譜柱時，發生(shēng)如(rú)下交換反應（洗脫反應爲交換反應的逆過程）：
抑制柱上發生(shēng)的反應：
R-H++Na+OH-===R-Na++H2O
R-H++Na+Br-===R-Na++H+Br-
可(kě)見(jiàn)，通過抑制柱将洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影(yǐng)響；試樣陰離(lí)子Br-則被轉化成了相(xiàng)應的酸H+Br-，可(kě)用電導法靈敏的檢測。
離(lí)子色譜法是溶液中陰離(lí)子分(fēn)析的最佳方法。也可(kě)用于陽離(lí)子分(fēn)析。
6．空間排阻色譜法StericExclusionChromatography
空間排阻色譜法以凝膠gel爲固定相(xiàng)。它類似于分(fēn)子篩的作(zuò)用，但(dàn)凝膠的孔徑比分(fēn)子篩要大(dà)得(de)多，一般爲數納米到數百納米。溶質在兩相(xiàng)之間不是靠其相(xiàng)互作(zuò)用力的不同來(lái)進行分(fēn)離(lí)，而是按分(fēn)子大(dà)小進行分(fēn)離(lí)。分(fēn)離(lí)隻與凝膠的孔徑分(fēn)布和溶質的流動力學體(tǐ)積或分(fēn)子大(dà)小有關。試樣進入色譜柱後，随流動相(xiàng)在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大(dà)的分(fēn)子不能進入膠孔而受到排阻，因此就(jiù)直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分(fēn)子可(kě)以進入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分(fēn)在柱上的保留值最大(dà)，在色譜圖上最後出現。
高效液相(xiàng)色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、．分(fēn)離(lí)系統、檢測系統和數據處理(lǐ)系統，下面将分(fēn)别叙述其各自(zì)的組成與特點。
1．進樣系統
一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作(zuò)，進樣量是恒定的。這對提高分(fēn)析樣品的重複性是有益的。
2．輸液系統
該系統包括高壓泵、流動相(xiàng)貯存器和梯度儀三部分(fēn)。高壓泵的一般壓強爲l．47～4．4X107Pa，流速可(kě)調且穩定，當高壓流動相(xiàng)通過層析柱時，可(kě)降低樣品在柱中的擴散效應，可(kě)加快(kuài)其在柱中的移動速度，這對提高分(fēn)辨率、回收樣品、保持樣品的生(shēng)物活性等都(dōu)是有利的。流動相(xiàng)貯存錯和梯度儀，可(kě)使流動相(xiàng)随固定相(xiàng)和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離(lí)子強度、PH值，或改用競争性抑制劑或變性劑等。這就(jiù)可(kě)使各種物質（即使僅有一個基團的差别或是同分(fēn)異構體(tǐ)）都(dōu)能獲得(de)有效分(fēn)離(lí)。
3.分(fēn)離(lí)系統
該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度爲10～50cm（需要兩根連用時，可(kě)在二者之間加一連接管），内徑爲2～5mm，由"優質不鏽鋼或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内裝有直徑爲5～10μm粒度的固定相(xiàng)（由基質和固定液構成）．固定相(xiàng)中的基質是由機(jī)械強度高的樹(shù)脂或矽膠構成，它們都(dōu)有惰性（如(rú)矽膠表面的矽酸基因基本已除去(qù)）、多孔性（孔徑可(kě)達1000?）和比表面積大(dà)的特點，加之其表面經過機(jī)械塗漬（與氣相(xiàng)色譜中固定相(xiàng)的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如(rú)磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體(tǐ)的有機(jī)化合物。因此，這類固定相(xiàng)對結構不同的物質有良好的選擇性。例如(rú)，在多孔性矽膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就(jiù)可(kě)以把成纖維細胞中的一種糖蛋白(bái)分(fēn)離(lí)出來(lái)。
另外，固定相(xiàng)基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀态，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區内傳質短(duǎn)。這些對縮小譜帶寬度、提高分(fēn)辨率是有益的。根據柱效理(lǐ)論分(fēn)析，基質粒度小，塔闆理(lǐ)論數N就(jiù)越大(dà)。這也進一步證明基質粒度小，會提高分(fēn)辨率的道理(lǐ)。
再者，高效液相(xiàng)色譜的恒溫器可(kě)使溫度從(cóng)室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短(duǎn)分(fēn)析時間，就(jiù)可(kě)增加層析柱的效率。
4．檢測系統
高效液相(xiàng)色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光(guāng)檢測器和熒光(guāng)檢測器三種。
（1）紫外檢測器
該檢測器适用于對紫外光(guāng)（或可(kě)見(jiàn)光(guāng)）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如(rú)蛋白(bái)質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可(kě)使用）；靈敏度高（檢測下限爲10-10g／ml）；線性範圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可(kě)檢測梯度溶液洗脫的樣品。
（2）示差折光(guāng)檢測器
凡具有與流動相(xiàng)折光(guāng)率不同的樣品組分(fēn)，均可(kě)使用示差折光(guāng)檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大(dà)多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作(zuò)簡單，但(dàn)靈敏度低（檢測下限爲10-7g／ml），流動相(xiàng)的變化會引起折光(guāng)率的變化，因此，它既不适用于痕量分(fēn)析，也不适用于梯度洗脫樣品的檢測。
（3）熒光(guāng)檢測器
凡具有熒光(guāng)的物質，在一定條件(jiàn)下，其發射光(guāng)的熒光(guāng)強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器隻适用于具有熒光(guāng)的有機(jī)化合物（如(rú)多環芳烴、氨基酸、胺類、維生(shēng)素和某些蛋白(bái)質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限爲10-12～10-14g／ml），痕量分(fēn)析和梯度洗脫作(zuò)品的檢測均可(kě)采用。
（5）數據處理(lǐ)系統
該系統可(kě)對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理(lǐ)等操作(zuò)，使樣品的分(fēn)離(lí)、制備或鑒定工(gōng)作(zuò)能正确開展。